KỸ THUẬT CẤY NẤM

1. MỤC ĐÍCH

Khảo sát trực tiếp cho ta biết là có nấm hoặc không có nấm trong bệnh phẩm, thường không cho ta biết chính xác loại vi nấm nào gây bệnh.

Ví dụ :

- Nấm ngoài da: chỉ biết có nấm hay không mà thôi.

- Viêm âm đạo: soi tươi huyết trắng thấy các tế bào hạt men, ta chỉ biết là bệnh nhân bị nhiễm nấm hạt men, chứ không biết tên loại nấm này. Nếu thấy tế bào hạt men và sợi tơ nấm giả thì ta có thể biết tên là giống Candida sp, chứ không xác định được tên loài.

Muốn biết chính xác bệnh do loại vi nấm nào phòng xét nghiệm phải thực hiện cấy nấm và định danh.

Khi cấy nấm, ta phải chọn môi trường cấy nấm thích hợp với mỗi loại bệnh phẩm và với loại nấm nghi ngờ.

2. MÔI TRƯỜNG DÙNG ĐỂ CẤY NẤM

Có rất nhiều loại môi trường, bao gồm những môi trường tự chế và có sẵn trên thị trường. Tùy theo loại bệnh phẩm mà ta chọn môi trường thích hợp:

- Môi trường Sabouraud là môi trường cơ bản thường được sử dụng nhiều nhất trong cấy nấm. Hầu hết các nấm đều có thể mọc trong môi trường này.

- Môi trường Sabouraud + kháng sinh thường được sử dụng cho bệnh phẩm da, áp xe và mô dưới da. Kháng sinh ngăn chặn nhiều vi trùng và làm giảm tốc độ mọc của nấm loạn nhiễm.

Kháng sinh thường được dùng: Chloramphenicol (<16g/ml); Gentamicin(5 - 100g/ml);

Penicillin (20U/ml); Streptomycin (40g/ml); Ciprofloxacin (5g/ml).

- Môi trường tim óc hầm (BHI) bổ sung kháng sinh: thường được sử dụng nhất, dùng cho bệnh phẩm lấy từ những nơi không vô khuẩn.

- Thạch bột bắp được dùng để định danh các loài Candida và C. albicans.

- Môi trường BHI và Sabhi thêm kháng sinh và 5 - 10% máu cừu: Giàu dinh dưỡng, thường được sử dụng để phát hiện những vi nấm nhị độ.

- Môi trường sinh sắc tố (CHROMagar Candida, BD CHROMagar Candida và Candida ID) dùng để phát hiện và định danh loài Candida.

- Một số môi trường như thạch Dextrose Sabouraud (SDA) thêm Cycloheximide (0,5g/ml) ức chế vi nấm hoại sinh nhưng cũng đồng thời ức chế một số vi nấm gây bệnh như Cryptococcus neoformans, Trichosporon asahii, một số loài Candida, Aspergillus và hầu hết Zygomyces.

3. KỸ THUẬT CẤY VI NẤM

3.1. Dụng cụ

- Kính hiển vi

- Kim cấy tròn hoặc thẳng

- Ông nghiệm hoặc hộp Petri

- Ông hút Pasteur

- Lam kính

- Lá kính

- Tủ ấm.

3.2. Kỹ thuật cấy

Tùy theo loại bệnh phẩm và môi trường:

1 Bệnh phẩm ướt, cặn lắng các dịch, cấy nấm men:

- Sử dụng kim cấy tròn hoặc thẳng giống kim cấy của vi trùng.

- Cấy 3 chiều giống cấy vi trùng.

2 Bệnh phẩm khô như: da, tóc, móng...., vi nấm dạng sợi:

- Dùng kim cấy đặc biệt cứng.

- Dìm bệnh phẩm hoặc mảng nấm vào trong môi trường cấy.

- Mẫu tóc, da: mỗi mẫu bệnh phẩm, cấy 3 - 5 ống môi trường.

3 Các bệnh phẩm vô trùng: máu, dịch não tủy,..

- Cấy vào BHI hay thạch máu trước khi cấy vào Sabouraud.

4. THỬ NGHIỆM SINH ỐNG MẦM

Được dùng để phân biệt Candida albicans hoặc không phải là Candida albicans.

4.1. Dụng cụ và hóa chất

- Kính hiển vi

- Ông nghiệm

- Ông hút Pasteur hoặc khuyên cấy vi trùng

- Lam kính

- Lá kính

- Huyết thanh người

- Bệnh phẩm hoặc gốc nấm.

4.2. Quy trình kỹ thuật

1 Lấy một ít nấm từ khuẩn lạc nấm hòa tan trong 1ml nước cất vô trùng tạo thành một huyền dịch vi nấm.

2 Nhỏ 1 - 2 giọt lứa cấy nấm hoặc lứa cấy từ môi trường Sabouraud lỏng vào một ống nghiệm có chứa 0,5ml đến 1ml huyết thanh.

3 Ủ 37oC từ 2 - 4 giờ.

4 Dùng ống hút Pasteur hoặc khuyên cấy lấy mẫu cấy nhỏ ra lam kính.

5 Đậy lá kính.

6 Soi tiêu bản dưới kính hiển vi với vật kính x10 và x40.

4.3. Kết quả

- Mọc ra 1 chồi dài: Candida albicans.

- Nảy búp: không phải Candida albicans.

Xét nghiệm này có độ chính xác cao. Có thể sử dụng huyết thanh người hay thú có khử hay không khử bổ thể đều cho kết quả.

5. KỸ THUẬT CẤY NẤM TRÊN KÍNH (SỬ DỤNG CHO NẤM SỢI TƠ)

5.1. Nguyên tắc

Với phương pháp cấy nấm trên kính: sự liên hệ giữa bào tử, cơ cấu sinh bào tử, nhánh nấm không bị xáo trộn.

5.2. Môi trường

Thạch Sabouraud hoặc thạch khoai đường: 15 - 20ml (cho 1 đĩa thạch).

5.3. Dụng cụ và thuốc thử

- Kính hiển vi

- Hộp Petri, đường kính 90mm

- Que thủy tinh hình chữ U, V

- Kim cấy

- Kẹp

- Lam kính

- Lá kính (tốt nhất cỡ 18 x 18mm)

- Nước cất vô trùng

- Gốc vi nấm cần cấy

- Phẩm xanh Lacto - phenol

- Dung dịch sát trùng.

5.4. Quy trình kỹ thuật

1 Đặt lam kính lên que thủy tinh uốn cong hình chữ U hay V.

2 Tất cả cho vào hộp Petri, đem hấp vô trùng.

3 Đổ thạch Sabouraud vào một Petri khác để nguội. Dùng dao vô trùng cắt thạch thành khối 1 x 1mm, đặt thạch lên lam kính.

4 Cấy nấm ở điểm giữa mỗi cạnh của khối thạch.

5 Hơ nhẹ lá kính lên ngọn đèn - đậy lá kính lên khối thạch.

6 Cho vào hộp 1 - 3ml nước cất vô trùng.

7 Đậy nắp hộp Petri, ủ nhiệt độ phòng thí nghiệm.

8 Theo dõi lứa cấy: khi thấy nấm mọc, gỡ lá kính đặt lên tấm lam kính có sẵn 1 giọt LPCB.

9 Dùng kim cấy lấy khối thạch trên lam cấy bỏ vào bình nước sát trùng.

10 Làm thêm một tiêu bản thứ 2: nhỏ 1 giọt LPCB lên nấm nơi miếng thạch vừa được lấy ra. Đậy lá kính lên.

Khảo sát tiêu bản dưới kính hiển vi.

Lưu giữ tiêu bản bằng cách dán kín xung quanh lá kính bằng keo sơn móng tay.

Ghi chú:

- Nấm hoại sinh mọc: 3 - 7 ngày.

- Nấm gây bệnh mọc: 2 - 3 tuần.

- Không nên cấy trên kính các loại nấm nguy hiểm.

Ví dụ: Histoplasma capsulatum

6. PHƯƠNG PHÁP DALMAU (Sử dụng cho vi nấm hạt men)

6.1. Môi trường và dụng cụ

- Kính hiển vi

- Kim cấy nấm

- Lá kính

- Gốc nấm cần định danh

- Ông nghiệm chứa NaCl 0,85% vô trùng

- Môi trường: thạch bột bắp.

6.2. Quy trình kỹ thuật

1 Đổ môi trường ra hộp Petri.

2 Lấy gốc nấm cần cấy hòa tan vào ống nghiệm có chứa NaCl 0,85% vô trùng (có thể lấy nấm từ lứa cấy lỏng).

3 Đốt kim cấy để nguội - lấy nấm.

4 Dùng kim cấy có nấm vạch sâu vào trong thạch 2 đường song song cách nhau khoảng 1cm.

5 Đốt khuyên cấy để nguội, vạch đường chữ Z trên 2 đường cấy.

6 Hơ lá kính trên ngọn đèn để sát trùng rồi phủ lên 2 đường cấy.

7 Ủ nhiệt độ phòng 3 - 5 ngày.

8 Khi thấy nấm mọc trên 2 đường cấy, khảo sát trực tiếp nấm trong hộp cấy dưới kính hiển vi.

Có thể đổ thạch trên lam kính và cấy giống như cấy trên hộp.

Hình 23.2. Kỹ thuật Dalmau

7. NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN Ủ

Tất cả mẫu cấy được ủ ở 30oC (±1oC) bởi vì nhiệt độ này thích hợp cho hầu hết vi nấm gây bệnh phát triển. Nếu không thể ủ ở 30oC, nên ủ ở nhiệt độ ,phòng (gần 25oC). Trước đây chúng ta thường ủ 4 tuần, nhưng một nghiên cứu gần đây cho rằng chỉ cần 3 tuần là đủ cho hầu hết vi nấm gây bệnh phát triển, ngoại trừ da, tóc, móng và bệnh phẩm tìm vi nấm nhị độ. Đối với bệnh phẩm tìm nấm men như hầu họng và âm đạo, chỉ cần ủ 7 ngày. Nên kiểm tra mẫu cấy ít nhất 2 hoặc 3 ngày mỗi lần trong 2 tuần đầu và hằng tuần trong các tuần tiếp theo.

8. CÁCH QUAN SÁT MỘT CANH CẤY NẤM

8.1. Khảo sát lứa cấy

- Một canh cấy cần phải giữ để quan sát trong một thời gian từ 1 - 3 tuần. Trong thời gian này, ta phải thường xuyên theo dõi sự tăng trưởng của nấm mỗi ngày hoặc 2 ngày 1 lần cho đến khi có khuẩn lạc nấm hoàn chỉnh.

- Tốc độ mọc của khuẩn lạc nấm:

+ Mọc nhanh: từ 2 - 5 ngày, thường là nấm men hoặc nấm hoại sinh.

+ Mọc chậm: sau 1,5 đến 2 tháng mới có khuẩn lạc nấm hoàn chỉnh: nhóm vi nấm gây bệnh ngoài da. Ví dụ: Trichophyton schoenleinii: mọc chậm.

+ Trung bình: từ 10 - 15 ngày.

+ Kết luận âm tính: sau 2 tháng.

8.2. Khảo sát đại thể khuẩn lạc nấm

a) Cấu tạo mặt trên của khuẩn lạc

Cấu tạo mặt trên đa dạng:

- Phẳng.

- Nhăn.

- Nhăn, ở giữa cao lên như miệng núi lửa. Ví dụ: Trichophyton tonsurans.

- Nhăn nheo từ trung tâm ra ngoại vi. Ví dụ: Penicillium sp.

- Giống như rắc bột: do vi nấm sinh nhiều bào tử. Ví dụ: Trichophyton mentagrophytes.

- Giống nhung: do vi nấm sinh sợi tơ nấm ngắn. Ví dụ: Microsporum canis.

- Giống len: do vi nấm sinh sợi tơ dài. Ví dụ: Mucor sp., Rhizopus sp.

- Giống sáp. Ví dụ: Trichophyton schoenleinii.

b) Màu sắc khúm nấm

- Mặt trên của khuẩn lạc nấm:

+ Màu sắc rất đa dạng: trắng vàng, vàng nâu, xanh lá cây, đỏ, đen,... tùy theo loại vi nấm.

+ Một khuẩn lạc nấm có thể có 2 màu. Ví dụ Aspergillus sp.: Phía trong có màu xanh hoặc nâu, phía ngoài có màu trắng.

+ Trên mặt khuẩn lạc nấm có thể đọng những giọt nước. Ví dụ Penicillium sp.

- Mặt dưới của khuẩn lạc nấm:

+ Sinh sắc tố: có những loại vi nấm không sinh sắc tố. Một số loại vi nấm sinh sắc tố. Ví dụ: Penicillium có màu vàng và nâu; Trichophyton sp. có màu đỏ, nâu; Epidermophyton sp. có màu vàng, xanh lá cây.

+ Phân bố sắc tố:

* Chung quanh khuẩn lạc. Ví dụ: Epidermophyton.

* Lan ra hết ống nghiệm hoặc đĩa cấy. Ví dụ: Trichoderma.

Ghi chú: khảo sát sắc tố nên so với ống Sabouraud không cấy nấm.

8.3. Khảo sát dưới kính hiển vi

- Dùng kim cấy lấy một mẫu khuẩn lạc nấm. Đặt mẫu nấm trên một lam kính đã có sẵn một giọt LPCB. Nếu cần, lấy hai kim tãi mỏng ra, đặt lá kính lên.

- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính x10, nếu cần xoay qua vật kính x40.

- Nếu thấy rõ bào tử và những cơ cấu đặc biệt khác, người ta có thể định danh được canh cấy nấm. Nhưng nhiều khi người ta cần làm thêm:

+ Cấy nấm trên miếng kính để xem vị trí của bào tử.

+ Dùng môi trường đặc biệt để cho sinh bào tử hay sinh ra cơ cấu đặc sắc của một loại nấm.

+ Khảo sát về tính chất sinh hóa học hay đặc tính khác của nấm.

+ Đôi khi phải dùng tới thú ở phòng thí nghiệm.

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1. Môi trường Sabouraud có thêm kháng sinh (Mycosel) có kết quả tốt cho tất cả các loại bệnh phẩm hay không? Giải thích.

2. Cấy tìm nấm trong dịch não tủy dùng kỹ thuật nào?

3. Kỹ thuật cấy nấm trên kính áp dụng cho loại bệnh phẩm nào? Mô tả quy trình cấy nấm trên kính

4. Anh (chị) cho biết mục đích của kỹ thuật Dalmau và mô tả kỹ thuật này.

5. Tại sao ta phải theo dõi một canh cấy nấm thường xuyên và trong thời gian dài?

Kỹ thuật cấy nấm trên kính

Stt

Thao tác

Yêu cầu phải đạt

1

Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để cấy nấm.

Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để cấy n

2

Cho que thủy tinh uốn cong hình chữ U hay V vào hộp Petri. Đặt lam kính lên que. Đậy nắp hộp Petri. Hấp vô trùng.

Lam kính nằm cân đối trên que thủy 1

3

Dùng dao vô trùng cắt thạch thành khối 1 x 1 mm, đặt thạch lên lam kính.

Khối thạch vuông đều, được đặt ngay ngắn ở giữa lam kính.

4

Cấy nấm ở điểm giữa mỗi cạnh của khối thạch.

Không làm vỡ thạch.

5

Hơ nhẹ lá kính lên ngọn đèn - đậy lá kính lên khối thạch.

Lá kính được đặt ngay ngắn, cân đối

6

Cho vào hộp 1 - 3ml nước cất vô trùng. Đậy nắp hộp Petri - ủ nhiệt độ phòng thí nghiệm.

Mực nước phủ kín đáy hộp Petri, khc lam kính.

7

Theo dõi lứa cấy.

Theo dõi hằng ngày.

8

Khi thấy nấm mọc, gỡ lá kính đặt lên tấm lam kính có sẵn 1 giọt LPCB.

Gỡ và đặt nhẹ lá kính lên lam kính.

9

Gạt bỏ khối thạch trên lam kính, cấy vào bình nước sát trùng.

Không để nấm vương ra xung quanh

10

Nhỏ lên chổ nấm mọc 1 giọt LPCB. Đậy lá kính lên.

Không để nước tràn ra xung quanh.

11

Soi tiêu bản để tìm nấm.

Thấy được sợi tơ nấm và bào tử (nếi

Kỹ thuật cấy nấm trên kính

Stt

Thao tác

Yêu cầu phải đạt

1

Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để cấy nấm.

Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để cấy nấm.

2

Đổ môi trường ra hộp Petri.

Lớp thạch trải đều, mặt thạch phẳng.

3

Hòa tan nấm với NaCl 0,85% vô trùng.

Nấm tan đều trong NaCl 0,85%.

4

Dùng kim cấy có nấm vạch sâu vào trong thạch 2 đường.

Đường vạch sắc nét, thẳng, cách nhau khoảnc thạch không bị vỡ.

5

Đốt khuyên cấy để nguội vạch đường chữ Z trên 2 đường cấy.

Thạch không bị vỡ.

6

Hơ lá kính trên ngọn đèn, phủ lên 2 đường cấy.

Lá kính được đặt ngay ngắn trên các đường v

7

Ủ nhiệt độ phòng 3 - 5 ngày.

Theo dõi nấm mọc hằng ngày.

8

Khi thấy nấm mọc trên 2 đường cấy, khảo sát trực tiếp nấm trong hộp cấy dưới kính hiển vi.

Thấy được nấm.

EBOOK GIÁO TRÌNH KÝ SINH TRÙNG THỰC HÀNH

CÁCH SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI
CÁCH CHUẨN ĐỘ KÍNH HIỂN VI
THU THẬP VÀ BẢO QUẢN PHÂN ĐỂ XÉT NGHIỆM TÌM KÝ SINH TRÙNG
KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PHÂN TÌM KÝ SINH TRÙNG
KỸ THUẬT TẬP TRUNG KÝ SINH TRÙNG TRONG PHÂN
CÁC KỸ THUẬT CHUYÊN BIỆT ĐỂ PHÁT HIỆN KÝ SINH TRÙNG ĐƯỜNG RUỘT
CẤY PHÂN
CÁC KỸ THUẬT NHUỘM MẪU PHÂN
ƯỚC LƯỢNG SỐ GIUN BẰNG CÁCH ĐẾM TRỨNG
KỸ THUẬT TÌM MỠ TRONG PHÂN
KỸ THUẬT TÌM MÁU TRONG PHÂN
KỸ THUẬT LÀM LÀN MÁU MỎNG VÀ GIỌT MÁU DÀY
KỸ THUẬT NHUỘM MÁU TÌM KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT
KỸ THUẬT KHẢO SÁT TIÊU BẢN MÁU
KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM TÌM GIUN CHỈ TRONG MÁU
PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HỌC
PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRA TIẾT TÚC
KỸ THUẬT BẢO QUẢN VÀ CHUYÊN CHỞ TIẾT TÚC
PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN TIẾT TÚC
KỸ THUẬT MỔ MUỖI
ĐẠI CƯƠNG XÉT NGHIỆM VI NẤM
KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM CƠ BẢN TÌM NẤM
KỸ THUẬT CẤY NẤM
HÌNH THỂ ẤU TRÙNG VÀ GIUN TRƯỞNG THÀNH
NHẬN DẠNG CÁC LOẠI SÁN LÁ
NHẬN DẠNG CÁC LOẠI SÁN DẢI (SÁN DÂY)
HÌNH THỂ TRỨNG GIUN, SÁN THƯỜNG GẶP
ĐƠN BÀO ĐƯỜNG RUỘT
NHỮNG VẬT THỂ CÓ THỂ TÌM THẤY TRONG PHÂN
HÌNH THỂ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT Ở NGƯỜI
HÌNH THỂ TIẾT TÚC Y HỌC
CHẨN ĐOÁN VI NẤM NGOÀI DA
CHẨN ĐOÁN VI NẤM NGOẠI BIÊN
CHẨN ĐOÁN VI NẤM CANDIDA
CHẨN ĐOÁN VI NẤM ASPERGILLUS
CHẨN ĐOÁN VI NẤM CRYPTOCOCCUS
VI NẤM HOẠI SINH
CÁC HÓA CHẤT THƯỜNG DÙNG TRONG XÉT NGHIỆM KÍ SINH TRÙNG ĐƯỜNG RUỘT
HÓA CHẤT – THUỐC NHUỘM – MÔI TRƯỜNG TRONG XÉT NGHIỆM NẤM

KEYWORD : Phác Đồ Chữa Bệnh, Bệnh Viện Bạch Mai, Từ Dũ , 115, Bình Dân, Chấn thương chỉnh hình, Chợ Rẫy, Đại học Y Dược, Nhân Dân Gia Định, Hoàn Mỹ, Viện Pasteur, Nhi Đồng Ung bướu, Quân Đội 103, 108,Phụ Sản Trung Ương, Bộ Y Tế,Phòng Khám, Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Hồ Chí Minh, Sài Gòn, Đà Nẵng, Huế, Vinh, Đồng Nai, Bình Dương, Hải Phòng, Quảng Ninh, Hiệu Quả Cao, Chữa Tốt, Khỏi Bệnh, Là Gì, Nguyên Nhân, Triệu Chứng, Ăn Uống, Cách Chữa, Bài Thuốc
Thông Tin Trên Web Là Tài Liệu Lưu Hành Nội Bộ Cho Các Bạn Sinh Viên - Y, Bác Sĩ Tham Khảo : Liên Hệ : Maikhanhdu@gmail.com