CÁC KỸ THUẬT NHUỘM MẪU PHÂN

Phương pháp soi tươi có giá trị rất lớn trong chẩn đoán các bệnh KST nói chung, nhưng không đủ cho việc nhận dạng đơn bào. Vì vậy, cần phải bổ sung thêm kỹ thuật nhuộm trong các kỹ thuật chẩn đoán bệnh KST, đặc biệt là đối với đơn bào. Nhuộm cố định là kỹ thuật quan trọng nhất để xác định nhiễm đơn bào đường ruột, vì nó giúp cho việc phân biệt các bộ phận hình thể khác nhau nhờ vào sự bắt màu khác nhau của những bộ phận đó. Phết nhuộm này được xem với vật kính dầu (độ phóng đại 1000 lần).

Có nhiều cách nhuộm, phổ biến nhất là nhuộm Trichrome (Wheatley - Gomori), nhuộm Haematoxylin sắt và nhuộm Zeihl - Neelsen cải tiến.

1. NHUỘM TRICHOME (GOMORI - WHEATLEY)

1.1. Mô tả

- Nhuộm Trichome là một kỹ thuật nhuộm nhanh, đơn giản để nhuộm đơn bào đường ruột, nhất là để xem các trùng roi, tế bào của người, nấm hạt men và các KST giả trong khoảng 45 phút.

- Có thể dùng để nhuộm mẫu phân tươi hoặc lưu trong cồn Polyvinyl hay phân mới được gắn với dung dịch Schaudinn.

- Không dùng để nhuộm mẫu phân đã được tập trung bằng formol - ether.

1.2. Vật liệu, hóa chất

a) Thuốc nhuộm Trichome

- Thành phần:

-

- Cách pha và bảo quản:

+ Cho 1,0ml acid acetic vào các chất nói trên.

+ Để yên trong 15 - 30 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Cho 100ml nước cất vào, dung dịch có màu tím.

+ Bảo quản trong lọ thủy tinh hoặc nhựa ở nhiệt độ phòng. Giữ được trong 24 tháng.

b) Dung dịch cồn ethylic-Iod

- Thành phần:

- Bảo quản trong lọ màu tối.

- Khi dùn2 pha loãn2 với cồn ethylic 70o cho tới khi có màu trà đậm.

- Giữ được khoảng 1 tuần hoặc tới khi nào thấy màu nhạt thì bỏ.

c) Dung dịch Acid - Cồn ethylic

1.3. Quy trình nhuộm

Cố định tiêu bản phân là bước rất quan trọng trong quá trình nhuộm để có được tiêu bản đẹp. Trước đây, người ta thường cố định tiêu bản phân bằng dung dịch Schaudinn vì nó định hình rất tốt thể hoạt động và bào nang của đơn bào, nhưng vì dung dịch Schaudinn có thủy ngân, rất độc, nên ngày nay người ta có thể dùng dung dịch Schaudinn để cố định hay bỏ tùy người sử dụng.

a) Quy trình cố định tiêu bản bằng dung dịch Schaudinn

© Nhúng ngay phết phân vừa làm xong vào trong dung dịch Schaudinn, để 30 phút hoặc qua đêm, sau đó lấy tiêu bản ra và nhúng lần lượt vào:

b) Quy trình không dùng dung dịch Schaudinn

Nhúng tiêu bản phân vào:

Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu x100, nền sẽ có màu đỏ hay xanh lá cây, đơn bào có màu xám nhạt hay lá cây xanh nhạt.

1.4. Kết quả

- Thể hoạt động và bào nang của đơn bào được nhận thấy dễ dàng.

- Trứng giun, sán và ấu trùng có thể khó nhận diện vì thuốc nhuộm đậm đặc.

- Có thể nhận ra nấm men, sợi tơ nấm giả và các bạch cầu.

- Không thấy được trùng bào tử như Cryptosporidium sp.

2. NHUỘM HAEMATOXYLIN SẮT (SPENCER- MONROE METHOD)

2.1. Mô tả

- Phương pháp này tốt để nhuộm đơn bào, tế bào của người, nấm men, tinh thể Charcot-leyden, không dùng để nhuộm trứng giun, sán hoặc ấu trùng vì chúng bị nhuộm đậm đen.

- Phương pháp này tốt để nhuộm tiêu bản phân tươi hoặc phân được bảo quản trong dung dịch PVA hoặc SAF.

- Phương pháp này cũng giống như nhuộm Trichome. Quy trình mô tả dưới đây là có cố định bằng dung dịch Schaudinn.

2.2. Vật liệu

- Kính hiển vi

- Lam kính

- Lá kính

- Que gỗ

- Bình thủy tinh để dung dịch nhuộm

- Kẹp

- Găng tay.

2.3. Hóa chất

a) Dung dịch A

- Thành phần:

Hòa tan Haematoxylin tinh thể vào 100ml cồn ethylic 95o, để yên ngoài ánh sáng trong 1 tuần, sau đó lọc.

b) Dung dịch B

- Thành phần:

- Khi dùng, trộn đồng thể tích dung dịch A và dung dịch B, trước khi nhuộm ít nhất 3 - 4 giờ.

c) Dung dịch Cồn ethylic-Iod

- Thành phần:

+ Iod tinh thể 1- 2g

+ Cồn ethylic 70o ^ Bảo quản trong lọ màu tối 100ml

- Khi dùng, pha loãng với cồn ethylic 70o cho tới khi có màu trà đậm.

- Giữ được khoảng 1 tới vài tuần hoặc tới khi nào thấy màu nhạt thì bỏ.

d) Dung dịch Acid - cồn ethylic

+ Cồn ethylic 90o 99,5ml

+ Acid acetic băng 0,5ml

2.4. Quy trình nhuộm

2.5. Kết quả

- Thể hoạt động và bào nang của đơn bào được nhận thấy dễ dàng.

- Trứng giun, sán và ấu trùng có thể khó được nhận diện vì thuốc nhuộm đậm đặc.

- Có thể nhận ra nấm men, sợi tơ nấm giả và các bạch cầu.

- Không thấy được trùng bào tử như Cryptosporidium sp.

2.6. Các vấn đề thường gặp

- Cố định tiêu bản: nếu không được làm tốt, có thể khó nhận diện đơn bào do bị biến dạng hoặc không ăn màu.

- Tiêu bản luôn được làm ráo trước khi chuyển từ bình này sang bình khác trong quá trình nhuộm bằng cách cầm tiêu bản theo chiều thẳng đứng, để cho 1 cạnh lam kính chạm vào giấy thấm để rút chất lỏng.

3. KỸ THUẬT NHUỘM ZIEHL-NEELSEN CẢI TIẾN

3.1. Mô tả

- Các trùng bào tử đường ruột (Cryptosporidium, Cyclospora...) khó được xác định bằng cách soi phân trực tiếp. Vì vậy, người ta dùng phương pháp nhuộm để tạo sự tương phản giữa màu của KST và nền cặn bã phân.

- Kỹ thuật nhuộm Ziehl-Neelsen cải tiến được dùng dựa trên đặc điểm kháng acid của các KST này. Nguyên tắc của kỹ thuật này là nhuộm tiêu bản phân bằng carbon fuschin, sau đó tẩy

màu và nhuộm nền tiêu bản bằng màu xanh. Do có tính kháng acid nên các trùng bào tử giữ lại màu hồng của fuschin.

- Kỹ thuật nhuộm Ziehl-Neelsen cải tiến có thể áp dụng cho phân tươi, hoặc phân được cố định trong formol, hoặc các loại bệnh phẩm khác như dịch hút tá tràng, mật, đàm (đờm).

3.2. Dụng cụ

- Kính hiển vi

- Lam kính

- Giá đựng lam kính

- Que tăm bông

- Găng tay.

3.3. Hóa chất

- Methanol

- Carbon-fuchsin

- Acid chlorhydric

- Cồn ethylic 95o

- Xanh Malachit 1% hoặc Xanh Methylen 1%. a) Pha Carbon Fuchsin

- Dung dịch A:

Fuchsin

Dung dịch B:

Trộn 10ml dung dịch A với 90ml B lại với nhau.

Bảo quản được 1 năm ở nhiệt độ phòng.

b) Pha dung dịch xanh Malachit

Có thể thay xanh Malachit bằng xanh Methylen. Bảo quản được 1 năm ở nhiệt độ phòng.

c) Pha dung dịch cồn - acid chlorhydric

3.4. Quy trình nhuộm

3.5. Các vấn đề thường gặp

- Nếu làm phết phân quá dày, thuốc nhuộm có thể không ngấm vào tất cả các KST, có thể làm sai lệch kết quả.

- Khi tẩy màu, nếu tẩy kỹ quá (thời gian tẩy kéo dài hoặc nồng độ acid đậm) sẽ làm cho KST không còn bắt màu sau khi nhuộm.

- Nếu nhiễm nhẹ, có thể không tìm thấy KST. Nên xét nghiệm 3 lần, mỗi lần cách nhau vài ngày để không bỏ sót ca bệnh.

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1. Tại sao phải nhuộm phân?

2. Có mấy phương pháp nhuộm phân?

3. Mô tả phương pháp nhuộm Trichome.

4. Nêu sự khác biệt giữa phương pháp nhuộm Trichome và Haematoxylin.

Kỹ thuật nhuộm Ziehl-Neelsen cải tiến

stt

Thao tác

Yêu cầu phải đạt

1

Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để làm tiêu bản phân.

Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để nhuộm phân.

2

Làm phết phân mỏng trên lam kính.

Phết phân mỏng, đều.

3

Để khô ngoài không khí.

Để khô tư nhiên.

4

Cố định bằng methanol trong 5 phút. Để khô ngoài không khí.

Đúng thời gian quy định.

5

Nhuộm với carbon-Fuchsin trong 5 phút.

Phủ thuốc nhuộm phết phân, không nghiêng đổ.

6

Rửa lam kính với nước.

Nhúng vào sâu vào chậu nước, tránh cặn bám vào tiêu bản.

7

Tẩy màu bằng cồn-acid cho tới khi màu không trôi ra nữa.

Nếu tẩy kỹ quá (thời gian tẩy kéo dài hoặc nồng độ acid đậm) sẽ làm cho KST không còn bắt màu sau khi nhuộm.

8

Rửa dưới vòi nước chảy

Dòng nước chảy vừa phải, không quá mạnh.

9

Nhuộm với 1% xanh Malachit trong 30 giây. Rửa tiêu bản dưới vòi nước. Để cho khô.

Đúng quy định.

10

Đặt tiêu bản lên bàn kính hiển vi. Tìm KST.

Soi đúng theo quy trình và quy định.

EBOOK GIÁO TRÌNH KÝ SINH TRÙNG THỰC HÀNH

CÁCH SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI
CÁCH CHUẨN ĐỘ KÍNH HIỂN VI
THU THẬP VÀ BẢO QUẢN PHÂN ĐỂ XÉT NGHIỆM TÌM KÝ SINH TRÙNG
KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PHÂN TÌM KÝ SINH TRÙNG
KỸ THUẬT TẬP TRUNG KÝ SINH TRÙNG TRONG PHÂN
CÁC KỸ THUẬT CHUYÊN BIỆT ĐỂ PHÁT HIỆN KÝ SINH TRÙNG ĐƯỜNG RUỘT
CẤY PHÂN
CÁC KỸ THUẬT NHUỘM MẪU PHÂN
ƯỚC LƯỢNG SỐ GIUN BẰNG CÁCH ĐẾM TRỨNG
KỸ THUẬT TÌM MỠ TRONG PHÂN
KỸ THUẬT TÌM MÁU TRONG PHÂN
KỸ THUẬT LÀM LÀN MÁU MỎNG VÀ GIỌT MÁU DÀY
KỸ THUẬT NHUỘM MÁU TÌM KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT
KỸ THUẬT KHẢO SÁT TIÊU BẢN MÁU
KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM TÌM GIUN CHỈ TRONG MÁU
PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HỌC
PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRA TIẾT TÚC
KỸ THUẬT BẢO QUẢN VÀ CHUYÊN CHỞ TIẾT TÚC
PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN TIẾT TÚC
KỸ THUẬT MỔ MUỖI
ĐẠI CƯƠNG XÉT NGHIỆM VI NẤM
KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM CƠ BẢN TÌM NẤM
KỸ THUẬT CẤY NẤM
HÌNH THỂ ẤU TRÙNG VÀ GIUN TRƯỞNG THÀNH
NHẬN DẠNG CÁC LOẠI SÁN LÁ
NHẬN DẠNG CÁC LOẠI SÁN DẢI (SÁN DÂY)
HÌNH THỂ TRỨNG GIUN, SÁN THƯỜNG GẶP
ĐƠN BÀO ĐƯỜNG RUỘT
NHỮNG VẬT THỂ CÓ THỂ TÌM THẤY TRONG PHÂN
HÌNH THỂ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT Ở NGƯỜI
HÌNH THỂ TIẾT TÚC Y HỌC
CHẨN ĐOÁN VI NẤM NGOÀI DA
CHẨN ĐOÁN VI NẤM NGOẠI BIÊN
CHẨN ĐOÁN VI NẤM CANDIDA
CHẨN ĐOÁN VI NẤM ASPERGILLUS
CHẨN ĐOÁN VI NẤM CRYPTOCOCCUS
VI NẤM HOẠI SINH
CÁC HÓA CHẤT THƯỜNG DÙNG TRONG XÉT NGHIỆM KÍ SINH TRÙNG ĐƯỜNG RUỘT
HÓA CHẤT – THUỐC NHUỘM – MÔI TRƯỜNG TRONG XÉT NGHIỆM NẤM

KEYWORD : Phác Đồ Chữa Bệnh, Bệnh Viện Bạch Mai, Từ Dũ , 115, Bình Dân, Chấn thương chỉnh hình, Chợ Rẫy, Đại học Y Dược, Nhân Dân Gia Định, Hoàn Mỹ, Viện Pasteur, Nhi Đồng Ung bướu, Quân Đội 103, 108,Phụ Sản Trung Ương, Bộ Y Tế,Phòng Khám, Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Hồ Chí Minh, Sài Gòn, Đà Nẵng, Huế, Vinh, Đồng Nai, Bình Dương, Hải Phòng, Quảng Ninh, Hiệu Quả Cao, Chữa Tốt, Khỏi Bệnh, Là Gì, Nguyên Nhân, Triệu Chứng, Ăn Uống, Cách Chữa, Bài Thuốc
Thông Tin Trên Web Là Tài Liệu Lưu Hành Nội Bộ Cho Các Bạn Sinh Viên - Y, Bác Sĩ Tham Khảo : Liên Hệ : Maikhanhdu@gmail.com