PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HỌC

- Ký sinh trùng sau khi xâm nhập vào cơ thể bệnh nhân có khả năng kích thích cơ thể sản xuất ra kháng thể đặc hiệu. Vì vậy, các nguyên lý chung về miễn dịch học đều có thể áp dụng được đối với các bệnh ký sinh trùng.

- Kỹ thuật miễn dịch được sử dụng trong các trường hợp mà phương pháp trực tiếp không thể làm được như:

+ Giai đoạn mới nhiễm: KST còn non, chưa đẻ trứng (sán lá gan, sán máng).

+ Trong giai đoạn mãn tính, KST đóng kén như Toxoplasma.

+ Mật độ ký sinh thấp như Trypanosoma.

+ KST định vị trong nội tạng sâu như bệnh amíp ở gan, gạo heo (lợn) ở cơ, não.

+ Ngõ cụt ký sinh như hội chứng ấu trùng di chuyển, KST ở dạng ấu trùng, không bao giờ tiến đến giai đoạn trưởng thành và không bao giờ hoàn tất chu trình phát triển như Toxocara sp.

Trong nhiều trường hợp, huyết thanh miễn dịch học tỏ ra thực tế hơn, nhất là trong các trường hợp mà cần lấy bệnh phẩm bằng kỹ thuật xâm lấn.

2. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HỌC

Phương pháp miễn dịch học áp dụng trong chẩn đoán bệnh KST bao gồm nhiều kỹ thuật như kết tủa, điện di, gắn bổ thể, ngưng kết, miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch phóng xạ, miễn dịch men.

Trước đây, kỹ thuật miễn dịch chỉ dựa vào kháng nguyên để phát hiện và đo lượng kháng thể luân lưu trong máu và các dịch sinh học. Độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm này tùy thuộc chủ yếu vào chất lượng của kháng nguyên, nếu kháng nguyên thô thì cho nhiều phản ứng chéo, dương

giả, kết quả dương tính không cho biết được bệnh đang mắc hay đã qua, vì kháng thể giảm rất chậm, từ vài tháng đến cả năm. Vì vậy, việc biện luận kết quả gặp nhiều khó khăn và cần thận trọng.

Vài năm gần đây, chúng ta có những bộ thử nghiệm phát hiện kháng nguyên để chẩn đoán một số bệnh đơn bào như bệnh do Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Trichomonas vaginalis và bệnh giun chỉ Wuchereria, sán máng Schistosoma sp.

So với nhóm trên, các kỹ thuật phát hiện kháng nguyên có giá trị chẩn đoán, kết quả dương tính xác định bệnh đang có.

3. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH MEN ELISA (ENZYME - LINKED - IMMUNOSORBENT ASSAY)

Kỹ thuật miễn dịch men có nhiều loại: trực tiếp, gián tiếp, kẹp chả, cạnh tranh. Hiện nay, trong chẩn đoán bệnh KST, kỹ thuật ELISA gián tiếp được ưa dùng vì nó có độ nhạy cao, thao tác đơn giản, ít tốn hóa chất, không đòi hỏi máy móc đắt tiền, có thể làm hàng loạt. Phần mô tả dưới đây là kỹ thuật miễn dịch men ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể trong máu bệnh nhân.

4. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH MEN ELISA GIÁN TIẾP PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ

Các từ viết tắt:

KN-KT = Phức hợp kháng nguyên kháng thể.

KKT = KT của động vật kháng với KT của người.

Cộng hợp = KKT gắn men.

4.1. Nguyên tắc

Kháng nguyên được gắn lên giếng nhựa, khi gặp kháng thể tương ứng sẽ kết hợp tạo thành phức hợp KN-KT. Phức hợp KN-KT được phát hiện nhờ men gắn vào KKT, men phản ứng với một cơ chất và làm đổi màu. Kết quả có thể được đọc bằng mắt hoặc máy đọc ELISA.

4.2. Dụng cụ và hóa chất

- Ông nghiệm

- Giá đựng ống nghiệm

- Micropipette có các thể tích khác nhau từ 1^l đến 1000^l

- Đầu nhựa gắn vào Micropipette, 2 loại: màu vàng (cho loại nhỏ) và màu xanh dương (cho loại to 100- 1000μl)

- Bình nhựa đựng nước rửa (0,5 lít, 1 lít)

- Giấy thấm để đập cho các giếng ráo nước

- Máy đọc ELISA (nếu có thì tốt, không có máy thì đọc kết quả bằng mắt)

- Bộ thử nghiệm gồm có:

+ Các thanh nhựa đã gắn kháng nguyên + Dung dịch rửa

+ Dung dịch pha loãng huyết thanh + Cộng hợp + Chứng âm + Chứng dương + Cơ chất

+ Chất ngưng phản ứng (acid hoặc bazơ).

4.3. Quy trình kỹ thuật

Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Quy trình gồm các bước sau đây:

1 Cho 100μl huyết thanh bệnh nhân, chứng âm, chứng dương vào giếng nhựa đã gắn sẵn kháng nguyên. Ủ ở 37oC trong 1 giờ.

2 Rửa 5 lần các giếng bằng dung dịch đệm PBS - Tween 20.

3 Đập cho ráo nước.

4 Cho 100μl cộng hợp vào mỗi giếng, ủ ở 37oC trong 1 giờ.

5 Rửa 5 lần các giếng bằng dung dịch đệm PBS - Tween 20.

6 Đập cho ráo nước.

7 Cho 100m1 cơ chất vào mỗi giếng, chờ cho màu xuất hiện (15 - 30 phút).

8 Cho acid hoặc bazơ vào để ngưng phản ứng.

9 Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA tự động hoặc bằng mắt.

Kết quả dương tính khi có hiện màu, âm tính thì không có màu.

Hình 16.1. Kỹ thuật ELISA gián tiếp

4.4. Biện luận kết quả

- Ngưỡng dương tính có thể khác nhau đối với từng loại bệnh KST. Biện luận kết quả dựa trên ngưỡng dương tính do nhà sản xuất đưa ra.

- Các kỹ thuật miễn dịch phát hiện kháng thể cho kết quả gián tiếp, không có giá trị tuyệt đối.

- Kết quả âm tính cũng không loại trừ hoàn toàn nhiễm KST, có thể do mới bị nhiễm, hoặc bị nhiễm quá lâu, hoặc lượng KST quá ít để có thể kích thích được hệ miễn dịch. Trong trường hợp nghi ngờ trên lâm sàng nên làm lại thử nghiệm. Xét nghiệm vài lần để theo dõi biến động của kháng thể có giá trị hơn là xét nghiệm một lần. Nếu cần, phải kiểm tra lại bằng các kỹ thuật khác.

- Kết quả dương tính cũng không khẳng định hoàn toàn bị nhiễm KST vì có thể dương tính giả do phản ứng chéo giữa các loại KST.

Vì vậy, các phản ứng miễn dịch tìm kháng thể không thể thay thế hoàn toàn xét nghiệm trực tiếp trong chẩn đoán nguyên nhân bệnh. Kết quả xét nghiệm, dù âm hay dương, cũng cần được xem xét một cách cẩn thận, kết hợp với các yếu tố dịch tễ và triệu chứng lâm sàng.

5. THỬ NGHIỆM NHANH TÌM KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT

Phương pháp này có mục đích phát hiện nhanh kháng nguyên hay kháng thể để chẩn đoán bệnh sốt rét, được thực hiện dưới dạng que nhúng, không đòi hỏi phương tiện gì khác ngoài bộ thử nghiệm.

5.1. Thử nghiệm Parasight F

Thử nghiệm này chỉ để chẩn đoán bệnh sốt rét do Plasmodium falciparum, bằng cách dùng kháng thể đơn dòng đặc hiệu để phát hiện Protein giàu Histidin (HRP-II) do Plasmodium falciparum thải ra trong máu bệnh nhân.

a) Dụng cụ và hóa chất

- Ống mao quản

- Ống nghiệm

- Giá để ống nghiệm

- Bộ thử nghiệm mua trên thị trường:

+ Dung dịch ly giải hồng cầu + Cộng hợp KKT- Sulfo-rhodamin B

+ Dung dịch rửa

+ Que nhúng là thanh nitrocellulose.

b) Quy trình kỹ thuật

- Lấy máu đầu ngón tay bằng ống mao quản.

- Cho 1 giọt máu vào trong 1 ống nghiệm có sẵn 3 giọt dung dịch ly giải hồng cầu.

- Nhỏ 1 giọt máu đã bị ly giải vào 1 giếng thử.

- Nhúng que thử vào giếng thử, chờ cho máu thấm lên que thử.

- Nhỏ 1 giọt cộng hợp vào giếng nhựa.

- Nhỏ 2 giọt nước rửa lên que nhúng để rửa hết máu.

- Đọc kết quả:

Thử nghiệm cho kết quả nhanh, trong vòng 10 phút, có độ nhạy, độ đặc hiệu từ 86 - 95% so với lam máu, nhưng kết quả dương tính không xác định được bệnh đang phát triển hay đã lui.

5.2. Thử nghiệm Optimal

- Có thể phát hiện cả 4 loại KST SR gây bệnh ở người.

- Dựa vào việc phát hiện men pLDH (Plasmodium lactate dehydrogenase), là một loại men do ký sinh trùng thải ra.

- Men pLDH chỉ được sản xuất ra bởi KST SR còn sống nên thử nghiệm này có khả năng phân biệt KST SR sống hay chết.

a) Dụng cụ và hóa chất

- Ống mao quản

- Ống nghiệm

- Giá để ống nghiệm

- Bộ thử nghiệm mua trên thị trường.

b) Quy trình kỹ thuật

- Nhỏ 1 giọt dung dịch đệm vào giếng thử và 4 giọt vào giếng rửa trên phiến nhựa.

- Lấy máu đầu ngón tay bằng ống mao dẫn.

- Nhỏ giọt máu vào giếng thử.

- Nhúng que thử vào giếng thử theo chiều thẳng đứng, để 10 phút cho máu thấm lên que thử.

- Chuyển que thử sang giếng rửa.

- Sau khi rửa, các vạch đỏ sẽ xuất hiện rõ trên que thử.

- Đọc kết quả:

+ Có 1 vạch đỏ: âm tính

+ Có 2 vạch đỏ: dương tính với 3 loại: P. vivax, P. ovale, P. malariae.

+ Có 3 vạch đỏ thì dương tính với P. falciparum.

+ Không có vạch nào: thử nghiệm không có giá trị.

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1.

Theo anh (chị), chẩn đoán bệnh KST bằng kỹ thuật miễn dịch có thể áp dụng cho những trường hợp

nào?

2.

Tại sao kỹ thuật miễn dịch men được sử dụng phổ biến trong chẩn đoán bệnh KST?

3.

Nêu nguyên lý của kỹ thuật ELISA.

4.

Mô tả kỹ thuật ELISA gián tiếp.

5.

Nêu những hạn chế của kỹ thuật Elisa phát hiện kháng thể.

6.

Kỹ thuật miễn dịch có thay thế được phương pháp soi trực tiếp trong chẩn đoán bệnh KST? Tại

sao?

7.

Mô tả thử nghiệm Parasight F.

8.

So sánh thử nghiệm Parasight F với phết máu trong chẩn đoán bệnh sốt rét.

Kỹ thuật ELISA

Stt

Thao tác

Yêu cầu phải đạt

1

Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để làm phản ứng.

Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để làm phản ứng.

2

Cho 100μl huyết thanh bệnh nhân, chứng âm, chứng dương vào giếng nhựa đã gắn sẵn kháng nguyên.

Lấy đúng khối lượng, bệnh phẩm tiếp xúc đều với mặt giếng, không có bọt khí.

3

Ủ ở 37oC trong 1 giờ.

Đúng thời gian theo quy định.

4

Rửa các giếng bằng dung dịch đệm PBS-Tween 20.

Rửa kỹ nhiều lần theo quy định.

5

Đập cho ráo nước.

Các giếng phải thật khô.

6

Cho 100μl cộng hợp vào mỗi giếng.

Lấy đúng khối lượng.

7

Ủ ở 37o trong 1 giờ.

Đúng thời gian theo quy định

8

Rửa các giếng bằng dung dịch đêm

Rửs -Tvveeng 0. ị ê

Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA tự động hoặc bằng mắt.

9

Đập cho ráo nước.

Các giếng phải thật khô.

10

Cho 100μl cơ chất vào mỗi giếng, chờ cho màu xuất hiên.

Lấy đúng khối lượng.

11

Cho acid hoặc bazơ vào để ngưng phản ứng.

Lấy đúng khối lượng. Nhỏ vào giếng đúng theo thời gian quy định.

12

Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA tự động hoặc bằng mắt.

Đọc trong khoảng thời gian theo quy định.

EBOOK GIÁO TRÌNH KÝ SINH TRÙNG THỰC HÀNH

CÁCH SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI
CÁCH CHUẨN ĐỘ KÍNH HIỂN VI
THU THẬP VÀ BẢO QUẢN PHÂN ĐỂ XÉT NGHIỆM TÌM KÝ SINH TRÙNG
KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PHÂN TÌM KÝ SINH TRÙNG
KỸ THUẬT TẬP TRUNG KÝ SINH TRÙNG TRONG PHÂN
CÁC KỸ THUẬT CHUYÊN BIỆT ĐỂ PHÁT HIỆN KÝ SINH TRÙNG ĐƯỜNG RUỘT
CẤY PHÂN
CÁC KỸ THUẬT NHUỘM MẪU PHÂN
ƯỚC LƯỢNG SỐ GIUN BẰNG CÁCH ĐẾM TRỨNG
KỸ THUẬT TÌM MỠ TRONG PHÂN
KỸ THUẬT TÌM MÁU TRONG PHÂN
KỸ THUẬT LÀM LÀN MÁU MỎNG VÀ GIỌT MÁU DÀY
KỸ THUẬT NHUỘM MÁU TÌM KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT
KỸ THUẬT KHẢO SÁT TIÊU BẢN MÁU
KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM TÌM GIUN CHỈ TRONG MÁU
PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HỌC
PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRA TIẾT TÚC
KỸ THUẬT BẢO QUẢN VÀ CHUYÊN CHỞ TIẾT TÚC
PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN TIẾT TÚC
KỸ THUẬT MỔ MUỖI
ĐẠI CƯƠNG XÉT NGHIỆM VI NẤM
KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM CƠ BẢN TÌM NẤM
KỸ THUẬT CẤY NẤM
HÌNH THỂ ẤU TRÙNG VÀ GIUN TRƯỞNG THÀNH
NHẬN DẠNG CÁC LOẠI SÁN LÁ
NHẬN DẠNG CÁC LOẠI SÁN DẢI (SÁN DÂY)
HÌNH THỂ TRỨNG GIUN, SÁN THƯỜNG GẶP
ĐƠN BÀO ĐƯỜNG RUỘT
NHỮNG VẬT THỂ CÓ THỂ TÌM THẤY TRONG PHÂN
HÌNH THỂ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT Ở NGƯỜI
HÌNH THỂ TIẾT TÚC Y HỌC
CHẨN ĐOÁN VI NẤM NGOÀI DA
CHẨN ĐOÁN VI NẤM NGOẠI BIÊN
CHẨN ĐOÁN VI NẤM CANDIDA
CHẨN ĐOÁN VI NẤM ASPERGILLUS
CHẨN ĐOÁN VI NẤM CRYPTOCOCCUS
VI NẤM HOẠI SINH
CÁC HÓA CHẤT THƯỜNG DÙNG TRONG XÉT NGHIỆM KÍ SINH TRÙNG ĐƯỜNG RUỘT
HÓA CHẤT – THUỐC NHUỘM – MÔI TRƯỜNG TRONG XÉT NGHIỆM NẤM

KEYWORD : Phác Đồ Chữa Bệnh, Bệnh Viện Bạch Mai, Từ Dũ , 115, Bình Dân, Chấn thương chỉnh hình, Chợ Rẫy, Đại học Y Dược, Nhân Dân Gia Định, Hoàn Mỹ, Viện Pasteur, Nhi Đồng Ung bướu, Quân Đội 103, 108,Phụ Sản Trung Ương, Bộ Y Tế,Phòng Khám, Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Hồ Chí Minh, Sài Gòn, Đà Nẵng, Huế, Vinh, Đồng Nai, Bình Dương, Hải Phòng, Quảng Ninh, Hiệu Quả Cao, Chữa Tốt, Khỏi Bệnh, Là Gì, Nguyên Nhân, Triệu Chứng, Ăn Uống, Cách Chữa, Bài Thuốc - Bài Giảng - Giáo Án - Điện Tử
Thông Tin Trên Web Là Tài Liệu Lưu Hành Nội Bộ Cho Các Bạn Sinh Viên - Y, Bác Sĩ Tham Khảo : Liên Hệ : Maikhanhdu@gmail.com